- úvod do problematiky, metody studia DNA, rozdíly mezi jednotlivými typy markerů
- extrakce DNA z rostlinného materiálu (CTAB metoda, komerční kit) - čerstvý i vysušený materiál
- elektroforéza, příprava agarosových minigelů, použití DNA ladderů (žebříčků)
- práce s dokumentačním systémem Kodak Gel Logic 100
- stanovení koncentrace extrahované DNA pomocí UV spektrofotometru (Nanodrop), ředění DNA
* 2. den
- PCR amplifikace, příprava směsi pro reakci, metody optimalizace reakčních podmínek
- zacházením s různými typy termocyclerů - vytváření nových programů, využití gradientového bloku pro optimalizaci PCR reakce
- metoda PCR - optimalizace PCR amplifikace pomocí gradientového bloku
- elektroforéza získaných PCR produktů a jejich visualizace
- práce se softwarem pro analýzu gelů (KODAK 1D Image Analysis Software) - stanovení přibližné délky získaných PCR produktů
* 3. den
- PCR amplifikace s použitím optimální teploty annealingu
- štěpení získaných PCR produktů několika restrikčními enzymy, elektroforéza výsledku štěpení DNA
* 4. den
- dominantní molekulární markery a jejich vyhodnocování - teorie
- analýza cvičných gelů, získávání matice dat
- hodnocení binární matice - program FAMD
- výpočty diverzity, PCoA, stromy, sítě, AMOVA - FAMD, AFLPdat, SplitsTree
* 5. den
- pokračování analýzy cvičných dat
- Bayesovský modelový přístup - program STRUCTURE
- vizualizace výsledků STRUCTURE analýzy - Structure-sum, Distruct
* 1st day
- introduction, methods of study of DNA, differences among molecular markers
- DNA extraction from plant material (CTAB method, commercial kit) - fresh and dried material
- electrophoresis, making agarose minigels, use of DNA ladders
- working with documentation system Kodak Gel Logic 100
- determining of DNA concentration using UV spectrophotometer (Nanodrop), DNA dilution
* 2nd day
- PCR amplification, making PCR premix, methods of PCR optimization
- working with diverse termocyclers - making new PCR programs, use of gradient block for PCR optimization
- PCR method - optimization using gradient block
- electrophoresis of PCR bands and their visualization
- working with the software for gel analysis (KODAK 1D Image Analysis Software) - estimation of the lengths of PCR bands
* 3rd day (PCR-RFLP)
- PCR amplification using optimal annealing temperature
- restriction of PCR bands with restriction endonucleases
* 4th day
- dominant molecular markers and data evaluation - theory
- analysis of test gels, preparing binary data matrix
- evaluation of the data - FAMD software
- diversity calculation, PCoA, trees, networks, AMOVA - FAMD, AFLPdat, SplitsTree
* 5th day
- continue with data analysis
- Bayesian model-based approach - STRUCTURE software
- visualization of the STRUCTURE results - Structure-sum, Distruct
*
1. den - úvod do problematiky, metody studia DNA, rozdíly mezi jednotlivými typy markerů - extrakce DNA z rostlinného materiálu (CTAB metoda, komerční kit) - čerstvý i vysušený materiál - elektroforéza, příprava agarosových minigelů, použití DNA ladderů (žebříčků) - práce s dokumentačním systémem Kodak Gel Logic 100 - stanovení koncentrace extrahované DNA pomocí UV spektrofotometru (Nanodrop), ředění DNA *
2. den - PCR amplifikace, příprava směsi pro reakci, metody optimalizace reakčních podmínek - zacházením s různými typy termocyclerů - vytváření nových programů, využití gradientového bloku pro optimalizaci PCR reakce - metoda PCR - optimalizace PCR amplifikace pomocí gradientového bloku - elektroforéza získaných PCR produktů a jejich visualizace - práce se softwarem pro analýzu gelů (KODAK 1D Image Analysis Software) - stanovení přibližné délky získaných PCR produktů *
3. den - PCR amplifikace s použitím optimální teploty annealingu - štěpení získaných PCR produktů několika restrikčními enzymy, elektroforéza výsledku štěpení DNA *
4. den - dominantní molekulární markery a jejich vyhodnocování - teorie- analýza cvičných gelů, získávání matice dat- hodnocení binární matice - program FAMD- výpočty diverzity, PCoA, stromy, sítě, AMOVA - FAMD, AFLPdat, SplitsTree *
5. den - pokračování analýzy cvičných dat- Bayesovský modelový přístup - program STRUCTURE- vizualizace výsledků STRUCTURE analýzy - Structure-sum, Distruct
Praktické seznámení s metodami molekulárních markerů v DNA laboratoři Katedry botaniky. Studenti se nejprve naučí extrahovat DNA z rostlinného materiálu a optimalizovat PCR reakci.
Ve druhé části si vyzkouší metodu PCR-RFLP na úsecích z chloroplastové DNA.