Sylabus
Experimentální část praktika kultivací zaměřeného na produkčn í bakteriální kmeny v kontinuálně míchaném bioreaktoru (CSTR) 1) Jednorázová vsádková fermentace v míchaném bioreaktoru - příklad produkce mikrobiálního produktu v uzavřeném systému, kdy všechny živiny budou v průběhu kultivace spotřebovávány, výsledkem bude akumulace biomasy a extracelulárního produktu. mikroorganismus: bakterie - Mn-rezistentní kmen Pseudomonas aeruginosa (kmen získán chemickou mutagenezí)
Průběh a podmínky kultivace: pracovní objem 3L, doba kultivace 24h (monitoring exponenciální a stacionární fáze růstu), komplexní medium 1% hydrolyzát kaseinu, příprava dvoustupňového inokula (ověření Mn rezistence) kultivační podmínky v CSTR: aerace 3 NL/min, počáteční pH 7.0 (v průběhu kultivace neregulováno), frekvence míchání 300 rpm (udržováno po celou dobu kultivace), kultivační teplota 25°C, pO2 v průběhu kultivace neregulovánoměřené parametry v průběhu kultivace: optická densita kultury, suchá hmotnost buněk, totální produkce extracelulárního produktu, specifická růstová rychlost, stanovení specifické produkce, stanovení produktivity (qp) a výtěžku (Yx/s), výpočet produkce volného pyoverdinu (ligandu) a komplexu ferripyoverdinu - spektrofotometrické stanovení absorbance supernatantu a výpočet množství pyoverdinu systémem dvou rovnic vycházejících z molárních extinkčních koeficientů pro pyoverdin a ferripyoverdin při dvou vlnových délkách (367 a 402 nm). 2) Přítokovaná fermentace v míchaném bioreaktoru - příklad kultivace rekombinantního vysoceexpresního bakteriálního systému, kdy živiny budou řízeně dávkovány v průběhu kultivace, rychlost přítoku zásobního roztoku substrátu je kontrolována koncentrací rozpuštěného kyslíku (pO2)mikroorganismus: rekombinantní bakterie - Escherichia coli RE3(pKA18) - produkční kmen pro periplasmatický enzym PGA (konstitutivní exprese genu)průběh a podmínky kultivace: pracovní objem 6L, definované minerální medium MCHGly, příprava dvoustupňového inokulakultivační podmínky v CSTR: aerace 6 NL/min, počáteční pH 7.0 a v průběhu kultivace udržováno pomocí 25% NH4OH, frekvence míchání 300 - 900 rpm - kaskáda pO2 pomocí otáček, kultivační teplota 28°C, pO2 udržováno na 20%, přítokovaná fáze - přítok substrátu je regulován koncentrací pO2 Vměřené parametry v průběhu kultivace: optické density, specifické růstové rychlosti, suché hmotnosti buněk, totální aktivity enzymu, stanovení specifické aktivity enzymu, stanovení zbytkové koncentrace substrátu v průběhu vsádkové fázezpracování vzorků na aktivitu - DSP pomocí ultrasonikace, French-Press, opakovaným zmrazováním a rozmrazováním buněk, kinetické stanovení aktivity kolorimetrickou metodou založenou na chromogenní reakci 6- aminopenicilánové kyseliny s p-dimethylaminobenzaldehydem (p-DAB).
Anotace
Praktikum doplňuje přednášku „Rekombinantní mikroorganismy v biotechnologiích“ o praktické úlohy pokročilé kultivací mikroorganizmů, které budou studenti jak samostatně provádět, tak vyhodnocovat. Praktikum je určeno pro magisterské studenty oboru Mikrobiologie i dalších oborů. Praktikum probíhá v Mikrobiologickém ústavu AV
ČR.