\r\n
Průtoková cytometrie.
průtokový cytometr a buněčný sorter, princip měření, dot plot, gateování populací, mnohobarevná průtoková cytometrie, hmotnostní cytometrie.
Pokročilé mikroskopické techniky
Atomic force microscopy, mikroskopie blízkého pole, TIRM, fluorescenční mikroskopie s vysokým rozlišením (4Pi, STED, PALM/STORM).
Metody budoucnosti
Sekvenace DNA třetí generace (sekvenace nanopórem a další vyvíjené techniky), single-cell techniky (laserová mikropreparace, optická pinzeta, magnetická pinzeta), DNA origami a DNA nanoarray, lab-on-chip - mikrofluidní čipy.
Genome manipulations and reverse genetics\r\nSelection and reporter genes, tools for genome manipulation (site-specific recombinases, site-specific endonucleases, homologous recombination)\r\nreverse genetics - random gene inactivation (transposon mutagenesis, TILLING, gene trap), targeted gene inactivation (knock-out, RNA-interference), regulated gene expression.\r\n\r\n\r\nGenomic modifications in model organisms\r\nCharacteristics and specifics of model organisms of molecular biology (E. coli, S. cerevisia, D. melanogaster, C. elegans, A. thaliana, mouse, human - tissue culture), creation of knock-out, conditional knock-out, knock-in, transformation methods, vectors.\r\n\r\n\r\nHuman gene modifications - gene therapy\r\nIn vivo and ex vivo gene therapy, stem cells, cloning, induced pluripotent cells, viral vectors for gene therapy (retroviral, adenoviral, AAV), their production, non-viral vectors (transposon), transfection methods, polymer carrier DNA design, gene therapy approaches (expression of functional allele of gene, expression of suicide gene, decrease of gene expression, repair of damaged gene), antisense therapy.\r\n\r\n\r\nDNA sequencing\r\nChronological view of sequencing methods (chemical degradation method, dideoxy method, pyrosequencing, second generation methods (454, Illumina, Ion Torrent), third generation methods (PacBio), de novo vs. re-sequencing, exome sequencing, genome sequencing, genomic projects .\r\n\r\n\r\nMethods of gene expression studies\r\nMethods of study of individual gene expression: EST, Northern blot, qRT-PCR (PCR kinetics, Ct value, probes for detection, normalization, PCR efficiency).\r\nMethods of study of transcriptome: DNA chips (principle, presentation of results: temperature maps, clustering; particular areas of use of DNA chips), RNA sequencing (RNA-Seq).\r\n\r\n\r\nProtein study methods\r\nProtein concentration determination, separation: PAGE (denaturing, native), staining, protein isolation and purification using affinity tags, immunolabeling-antibodies (primary, secondary, detection, production), immunoprecipitation,\r\nWestern blot, ELISA, methods of determination of protein-protein interactions at the level of individual proteins (pull-down assay, proximity ligation assay) and whole proteome (coimmunoprecipulation, TAP, 2-hybrid system, complement assay, phage display), degron, protein arrays ( analytical vs. functional chip).
\r\nProteomics\r\nmass spectrometry: separation, ionization techniques, types of analyzers, tandem MS.\r\n\r\n\r\nFluorescence and fluorescent labeling\r\nFundamentals of fluorescence, filters and light sources, fluorescent labeling of cells and organelles, use of fluorescent probes, fluorescent probes for measuring intracellular pH, ion concentration, membrane potential.\r\nFluorescence microscope, confocal microscope and two-photon confocal microscope. Green fluorescent protein (GFP) and its variants. Possibilities of using fluorescent proteins, FRET, FRAP, FLIM.\r\n\r\n \r\n\r\nFlow cytometry.\r\nflow cytometer and cell sorter, principle of measurement, dot plot, population gateway, multicolour flow cytometry, mass cytometry.\r\n\r\n\r\nAdvanced microscopic techniques\r\nAtomic force microscopy, near field microscopy, TIRM, high resolution fluorescence microscopy (4Pi, STED, PALM / STORM).\r\n\r\n\r\nMethods of the future\r\nThird-generation DNA sequencing (nanopore sequencing and other techniques developed), single-cell techniques (laser micropreparation, optical tweezers, magnetic tweezers), DNA origami and DNA nanoarray, lab-on-chip microfluidic chips.
\r\n
\r\nGenomové manipulace a reverzní genetika Selekční a reportérové geny, nástroje pro manipulaci s genomem (místně specifické rekombinázy, místně specifické endonukleázy, homologní rekombinace) reverzní genetika - náhodná inaktivace genu (transpozonová mutageneze, TILLING, genová past), cílená inaktivace genu (knock-out, RNA-interference), regulovaná exprese genu. Genomové modifikace u modelových organizmů Charakteristika a specifika modelových organismů molekulární biologie (E. coli, S. cerevisie, D. melanogaster, C. elegans, A. thaliana, myš, člověk - tkáňové kultury), vytváření knock-outů, podmíněných knock-outů, knock-inů, metody transformace, vektory. Genové modifikace člověka - genová terapie In vivo a ex vivo genová terapie, kmenové buňky, klonování, indukované pluripotentní buňky, virové vektory pro genovou terapii (retrovirové, adenovirové, AAV), jejich produkce, nevirové vektory (transpozonové), metody transfekce, design polymerních nosičů DNA, přístupy genové terapie (exprese funkční alely genu, exprese sebevražedného genu, snížení exprese genu, oprava poškozeného genu), antisense terapie. Sekvenace DNA Chronologický pohled na sekvenační metody (metoda chemické degradace, dideoxy metoda, pyrosekvenování, metody druhé generace (454, Illumina, Ion Torrent),metody třetí generace (PacBio), sekvenace de novo vs. resekvenace, sekvenace exomu, postup sekvenace genomů, genomové projekty. Metody studia genové exprese Metody studia exprese jednotlivých genů: EST, Northern blot, qRT-PCR (kinetika PCR, hodnota Ct, sondy pro detekci, normalizace, efektivita PCR). Metody studia transkriptomu: DNA čipy (princip, prezentace výsledků: teplotní mapy, clusterování; dlaší oblasti použití DNA čipů), sekvenace RNA (RNA-Seq). Metody studia proteinů Stanovení koncentrace proteinů, separace: PAGE (denaturační, nativní), barvení, Izolace a purifikace proteinů s využitím afinitních tagů, imunoznačení-protilátky (primární, sekundární, způsoby detekce, výroba), imunoprecipitace, Western blot, ELISA, metody stanovení protein-proteinových interakcí na úrovni jednotlivých proteinů (pull-down assay, proximity ligation assay) i celého proteomu (koimunoprecipirace, TAP, 2-hybridový systém, komplementační assay, phage display), degron, protein arrays (analytický vs. funkční čip). Proteomika hmotnostní spektrometrie: separace, ionizační techniky, typy analyzátorů, tandemová MS. Fluorescence a fluorescenční značení Základy fluorescence, filtry a zdroje světla, fluorescenční značení buněk a organel, použití fluorescenčních sond, fluorescenční sondy pro měření vnitrobuněčného pH, koncentrace iontů, membránového potenciálu. Fluorescenční mikroskop, konfokální mikroskop a dvoufotonový konfokální mikroskop. Zelený fluorescenční protein (GFP) a jeho varianty. Možnosti využití fluorescenční proteinů, FRET, FRAP,FLIM.
Průtoková cytometrie.průtokový cytometr a buněčný sorter, princip měření, dot plot, gateování populací, mnohobarevná průtoková cytometrie, hmotnostní cytometrie. Pokročilé mikroskopické techniky Atomic force microscopy, mikroskopie blízkého pole, TIRM, fluorescenční mikroskopie s vysokým rozlišením (4Pi, STED, PALM/STORM). Metody budoucnosti Sekvenace DNA třetí generace (sekvenace nanopórem a další vyvíjené techniky), single-cell techniky (laserová mikropreparace, optická pinzeta, magnetická pinzeta), DNA origami a DNA nanoarray, lab-on-chip - mikrofluidní čipy.
Pro akademický rok 2021/2022: přednášky budou probíhat prezenčně podle rozvrhu. Prezentace, odkazy na přednášky a další materiály budou k dispozici na Moodle https://dl2.cuni.cz/course/view.php?id=283 heslo pro vstup je: metodymb
Přednáška nabízí přehled širokého spektra laboratorních metod používaných v současné molekulární a buněčné biologii. Předpokládají se základní znalosti molekulární biologie, biologie buňky a genového inženýrství.