Buňky a tkáně in vitro

Sylabus

Přednáška :

1. Vybavení: sterilní místnost, box, laminární box, termostat, CO2 termostat.

2. Materiály a jejich vlastnosti: sklo, polyethylen, polypropylen, polystyren, PVC, teflon, fenolformaldehyd, guma, silikon, kovy, buničina, papír.

3. Voda: znečištěniny, destilace, reversní osmóza, deionizace, aktivní uhlí, sterilizace.

4. Kontaminace.

5. Aseptická technika.

6. Mytí a úprava povrchu.

7. Sterilizace: suché a vlhké teplo, ozáření, filtrace, plyny a páry, desinfekce povrchů.

8. Základní podmínky života: osmolarita, pH, pufrování, CO2, teplota.

9. Média a suplementy: balancované solné směsi, média, glutamin, antibiotika, bikarbonát, sérum, bezsérová média.

10. Typy kultur: tkáňové, buněčné, kmenové buňky, linie, růst a evoluce kultury.

11. Primární kultury: zdroje tkání, fragmenty a suspense.

12. Udržování kultury: subkultura, výměna média, disagregace buněk, klonování, zamražování.

13. Frakcionace a separace buněk.

14. Pozorování a měření: hemocytometr, cell counter, kalibrace, histochemie, pozorování a měření NK (DAPI, Hoechst), viabilita a cytotoxicita (dye exclusion, tetrazoliové soli). Stanovení proteinů (Lowry, Bradfordová, UV), stanovení DNA (DAPI, EtBr), značení živých buněk.

15. Karyologie: příprava roztěrů, barvení, pruhování chromozómů, hybridizace in situ.

16. Transformace buněk: nádorová transformace, kontaktní inhibice, imortalizace kultur, buněčná fúze, transfekce buněk (positivní a negativní selekce, GFP, lipofekce, elektroporace), COS buňky. Praktická cvičení :

1. Příprava primární kultury, příprava média.

2. Udržování kultury: pasážování, zamražování, rozmražování.

3. Klonování v agaru.

4. Karyotyp myši.

5. Kultivace a fixace buněk na skle, imunofluorescenční barvení cytoskeletu buněk. Předmět je vyučován za podpory projektu Zvýšení kvality vzdělávání na UK a jeho relevance pro potřeby trhu práce, reg.č. CZ.02.2.69/0.0/0.0/16_015/0002362.

Anotace

Přednáškový kurz (1/3) a cvičení (2/3) jsou zaměřeny na získání znalostí pro práci s buněčnými a tkáňovými kulturami živočichů. Důraz je kladen, jak na odborné znalosti, tak na technické vybavení a bezpečnost.

V první části kurzu je probíráno vybavení laboratoře, materiály a jejich vlastnosti, voda, sterilizace, média a suplementy pro živočišné kultury. Druhá část kurzu je zaměřena na založení a udržování kultury včetně disagregace buněk.

Dále pak na frakcionaci buněk, pozorování a měření buněk, stanovení proteinů a DNA, histochemické a karyologické techniky. Součástí kurzu je i transfekce buněk, imortalizace kultur a nádorová transformace.

Praktická cvičení jsou turnusová.