Sylabus
1. Teorie elektromigrace - síly působící při elektromigraci, elektroforetická mobilita, vliv iontové síly, vliv pH, relaxační efekt, elektroforetický efekt, elektroosmotický tok.
2. Účinnost separace - praktické dopady nízké/vysoké účinnosti na výsledky analýzy, model teoretických pater, vyjádření účinnosti, příspěvky k rozšiřování zón (difúze, délka zóny vzorku, Jouleovo teplo, adsorpce na stěny, detekční cela, elektromigrační disperze).
3. Instrumentace - základní součásti přístroje, separační kapiláry, proud a jeho stabilita, dávkování vzorku, techniky zakoncentrování analytů zesílením pole, detekce (přímá a nepřímá UV/VIS, fluorescenční, bezkontaktní vodivostní, systémové píky), separace na krátkém konci kapiláry, frekvence sběru dat.
4. Separační módy I Kapilární zónová elektroforéza (CZE) - separační mechanismus, volba základního elektrolytu, jeho pH a iontové síly, úprava směru a rychlosti elektroosmotického toku, dynamické a permanentní pokrytí kapiláry. Micelární elektrokinetická chromatografie (MEKC) - separační mechanismus, micely jako pseudostacionární fáze, eluční okno, tenzidy používané v MEKC. Kapilární elektrochromatografie (CEC) - separační mechanismus, stacionární fáze, elektroosmotický tok, srovnání s kapalinovou chromatografií.
5. Separační módy IIKapilární gelová elektroforéza (CGE) - separační mechanismus, fyzikální a chemické gely pro CGE, sekvenování DNA, Sangerova metoda. Kapilární isoelektrická fokusace (CIEF) - separační mechanismus, tvorba gradientu pH, mobilizace systému. Kapilární isotachoforéza (CITP) - separa ční mechanismus, vedoucí a koncový elektrolyt, samozaostřující efekt, specifika experimentálního záznamu v ITP, využití přechodného isotachoforetického efektu pro zakoncentrování analytů v CZE. Kapilára jako mikroreaktor - provádění enzymových reakcí a derivatizace analytů v kapiláře. Elektroforetické a difuzní mísení zón.
Anotace
Předmět podává přehled o elektromigračních analytických metodách z teoretické i praktické stránky a je vyučován metodikou převrácené třídy (flipped classroom). Výuka probíhá dvoufázově. 1) Jeden týden je vždy určen pro samostudium. Studenti si sami prostudují materiály, které mají k danému tématu dostupné v Moodle a rovněž přes Moodle odevzdají domácí úkoly, na jejichž základě vyučující získá lepší přehled o věcech, které je třeba dovysvětlit. Domácí úkoly se nezapočítávají do konečného hodnocení, slouží pouze k ověření pochopení látky ze samostudia. Usoudí-li však vyučující, že danému úkolu nebyla věnována dostatečná pozornost studenta nebo došlo k výraznému nepochopení tématu, může požádat o dodatečné přepracování. 2) Následující týden proběhne prezenční výuka, v rámci které se dovysvětlí problematické pasáže a při řešení různých úkolů a problémů studenti využijí a zafixují si poznatky získané při samostudiu.
Student po absolvování jednotlivých částí: 1 Teorie
Popíše síly působící na ion v elektrickém poli.
Definuje a vysvětlí pojmy migrační čas, elektroforetická mobilita (pozorovaná, efektivní), elektroosmotický tok.
Interpretuje elektroferogram.
Na základě elektroferogramu vypočte pozorovanou a efektivní mobilitu analytu.
Popíše vliv experimentálních podmínek (složení základního elektrolytu, pH, iontová síla, napětí, rozměry kapiláry, teplota) a vlastností analytů náboj, velikost) na jejich elektroforetickou mobilitu a rychlost elektroosmotického toku.
V programu Peakmaster vypočte na základě složení základního elektrolytu jeho pH a iontovou sílu.
V programu Peakmaster zvolí složení základního elektrolytu, které bude mít zadané pH a iontovou sílu.
V programu Peakmaster provede simulaci elektroforetické separace. 2 Účinnost separace
Definuje pojem účinnost separace.
Vysvětlí výhody vysoké účinnosti separace.
Vyjmenuje faktory ovlivňující účinnost separace a popíše jejich vliv.
Vyjmenuje opatření, kterými lze omezit přehřívání roztoku v kapiláře.
Definuje pojem elektromigrační disperze a vysvětlí mechanismus jejího vzniku.
Identifikuje píky deformované elektromigrační disperzí. 3 Instrumentace
Vyjmenuje a popíše základní součásti elektroforetického přístroje.
Vysvětlí rozdíl mezi hydrodynamickým a elektrokinetickým dávkováním vzorku. Popíše výhody a nevýhodou obou technik.
Popíše princip prekoncentračních technik field-amplified sample stacking, field amplified sample injection, large-volume sample stacking, pH-mediated sample stacking a transient isotachophoresis.
Vysvětlí princip detekčních technik a popíše jejich výhody a nevýhody: přímá UV, nepřímá UV, fluorescenční, bezkontaktní vodivostní detekce.
Odhadne, zda pro zadaný základní elektrolyt a analyty poskytne daná detekční technika signál a zda píky budou kladné nebo záporné.
Zvolí vhodnou detekční techniku pro zadané analyty.
Vysvětlí pojem "separace na krátkém konci".
Vypočte přibližný migrační čas analytu při zadané celkové a efektivní délce kapiláry na základě migračního času v kapiláře o jiné celkové a efektivní délce.
Identifikuje látky v elektroferogramu na základě elektroferogramů standardů a UV spekter jednotlivých píků. 4 Separační módy I
Popíše princip separace v těchto separačních módech: Kapilární zónová elektroforéza, micelární elektrokinetická chromatografie, kapilární elektrochromatografie.
Vyjmenuje parametry, které je nutno zvážit při optimalizaci metody kapilární zónové elektroforézy a popíše jejich vliv na separaci.
Navrhne smysluplný základní elektrolyt pro separaci zadaných analytů pomocí kapilární zónové elektroforézy.
S využitím programu Peakmaster optimalizuje podmínky elektroforetické separace (k dosažení zadaného rozlišení či účinnosti separace).
Na základě experimentálních podmínek určí směr elektroosmotického toku.
Popíše způsoby, kterými lze ovlivnit rychlost a směr elektroosmotického toku. 5 Separační módy II
Popíše princip separace v těchto separačních módech: Kapilární gelová elektroforéza, kapilární isoelektrická fokusace a kapilární isotachoforéza.
Popíše princip Sangerovy metody sekvenování DNA.
Dle vedoucího a koncového elektrolytu rozliší, zda je isotachoforetický systém určen pro separaci kationtů nebo aniontů.
Vysvětlí, jakým způsobem je možné elektroforetickou kapiláru využít jako mikroreaktor.
Navrhne postup dávkování reaktaktů do kapiláry pro provedení chemické/biochemické reakce.
Zvolí vhodný separační mód pro zadané analyty.
Obecné/platí pro několik kapitol současně
Na základě zadaných experimentálních podmínek a vlastností analytů odhadne pořadí analytů v elektroferogramu v různých separačních módech.
Identifikuje chybu v experimentálních podmínkách elektromigrační separace a navrhne funkční nápravu.