Sylabus
1) Úvod do fluorescence: Jablonskiho diagram; absorpční a emisní spektra; fluorescenční značky;kinetika vyhasínání; fluorescenční decay; průměrná doba života; kvantový výtěžek fluorescence;zhášení fluorescence;2) Detekce jednotlivých molekul: principiální rozdíly vůči klasickému měření fluorescence ze souborumnoha molekul; fotofyzika jednotlivých molekul; metody detekce fluorescence; konfokální versus wide-filed mikroskop; metoda TIRF (total internal reflection fluorescence); detekce různýchproteinových konfigurací pomocí sm-FRET techniky; rotace a reorientace jednotlivých molekul;3) Stopování jednotlivých molekul (Single particle tracking, SPT): difúze ve dvou rozměrech; náhodnáprocházka; MSD diagramy; různé módy difúze: volná, ‚hindered‘ a hop-difúze. Metody měření SPT;odvozené techniky: analýza svítivosti a TOCCSL (thining out clusters while conserving stochiometryof labelling); kolokalizační analýza4) Fluorescenční korelační kroskorelační spektroskopie (FCS a FCCS) I: teorie FCS: autokorelační akroskorelační funkce; translační difúze v FCS; inter-system crossing v FCS;5) FCS a FCCS II: FCS ve dvou dimenzích: aplikace na membrány; FLCS technika; praktické aplikaceFCS: reakční kinetika, vázání proteinů na membránu, klastrování proteinů na membráně;6) PCH – photon counting histogram: principy a aplikace v biofizice; shot noise; Number and brightnessmetoda (N&B); fluorescence antibunching;7) Depolarizace fluorescence: definice anisotropie; metody její detekce; excitační a emisní anisotropickáspektra; důvody depolarizace fluorescence; kinetika vyhasínání anisotropie; efekty rotační difúze nafluorescenční anisotropii;8) Försterův přenos energie (hetero-FRET): FRET v rámci jednoho donor-akceptorového páru; migraceenegie mezi dvěma donory (homo-FRET); kinetika vyhasínání fluorescence a anisotropie; singlemolecule FRET9) Försterův přenos a migrace energie v poli mnoha donorů a akceptorů: kinetika vyhasínánífluorescence v poli mnoha akceptorů, FRET na lipidové dvojvrstvě, určení šířky lipidové dvojvrstvy;MC-FRET; detekce lipidových nanodomén; oligomerizace proteinů na membráně – kvantifikacepomocí homo- a hetero-FRETu10) Raster Image Correlation Spectroscopy (RICS) a Imaging-FCS: Principy a praktické aplikace
Anotace
Fluorescenční spektroskopie založená na detekci jednotlivých molekul (single molecule fluorescence spectroscopy) zažila v nedávné době nebývale rychlý rozvoj a stala se tak jednou z nepostradatelných metod v oblasti biofyziky. Cílem tohoto kurzu je teoreticky seznámit posluchače s tímto oborem. Důraz je kladen především na porozumění fyzikálně-chemických principů, na nichž jsou tyto metody založeny.
Užitečnost těchto fluorescenčních technik je demonstrována na mnoha praktických příkladech z oblasti biofyziky.