Sylabus
TECHNOLOGIE A METODY ANALÝZY NUKLEOVÝCH KYSELIN sylabus semináře LS, 0/2 Z Mgr. Richard Marván
1. Buněčné extrakce a izolace DNA Obecné principy, příprava biologického materiálu, uvolnění NK z buněk, ochrana DNA před účinkem nukleáz, zvláštnosti izolace DNA a RNA, metody - organická extrakce, extrakce varem, extrakce lýzou, extrakce chelatačním činidlem, Millerova metoda, extrakce adsorpcí, komerčně dostupné izolační soupravy, zakoncentrování DNA, účinnost izolačních metod, stanovení koncentrace NK.
2. Fragmentace DNA Restrikční endonukleázy, palindromové sekvence, typy štěpení, restrikční mapy, polymorfie délky restrikčních fragmentů (analýza RFLP), enzymatická degradace DNA, mechanické přetrhávání vláknitých molekul DNA.
3. Hybridizace NK DNA sondy, detekce mutací, Southern, Northern a Western blotting - přenos fragmentů na membrány, značení sond pro hybridizace a používání těchto technik v praxi, prehybridizační a hybridizační podmínky analýzy, autoradiografie jako metoda detekce fragmentů NK, fluorescentní hybridizace in situ /FISH/.
4. Klonování a genové inženýrství Klony, klonování rostlin, metody klonování živočichů, klonování NK - DNA-ligáza, vlastnosti a typy klonovacích vektorů, genomová DNA knihovna, cDNA knihovna, syntéza NK podle předlohy a bez předlohy, produkce vzácných proteinů klonováním DNA, mutantní organismy, transgenní živočichové a etické otázky.
5. Embryonální a dospělé kmenové buňky Metoda a terapeutický potenciál, linie buněk ve světě, současná situace ve výzkumu a legislativě, etické otázky.
6. Polymerázová řetězová reakce (PCR) - obecné principy Princip a problémy, standardní postup a jeho varianty - komponenty reakční směsi, aparatura, amplifikace delších sekvencí, technika "horkého" startu.
7. Specializované techniky PCR Inverzní PCR, asymetricá PCR, multiplex PCR, mutageneze pomocí PCR, značení DNA, PCR a klonování, RT PCR, PCR in situ, PCR ELISA, purifikace produktů amplifikace, detekce a kvantifikace produktů pomocí RT PCR.
8. Sekvence nukleových kyselin Maxam-Gilbertova metoda, Sangerova metoda a její modifikace, projekt sekvenování lidského genomu (HGP) - důsledky, projekty sekvenování genomů našich nejbližších žijících příbuzných, sekvenování RNA, vyhodnocování sekvenogramů a jeho úskalí.
9. Separace a detekce fragmentů Ultracentrifugace, chromatografické dělení, gelová elektroforéza (AGE, PAGE), kapilárová elektroforéza, značení fragmentů - radioaktivní, fluorescentní, enzymatické, barvení stříbrem, fragmentární analýza jako důležitý nástroj současné identifikace jedince.
10. Technologie DNA čipů Metoda, aparatura, příklady využití, příprava sond pro "spotování" čipů, tištění čipů, expresní analýza RNA, příprava cDNA čipů na membráně, význam tkáňové mikrodisekce pro přesnost genetické analýzy, tkáňové mikročipy, použití mikročipů pro genomovou analýzu, mikročipová bioinformatika.
11. Genová terapie u lidí Metoda, výsledky, problémy a etické otázky, možnosti chybné interpretace genetické analýzy v důsledku uskutečněné genové terapie jedince.
12. Přehled a shrnutí
Anotace
Povinně volitelný kurz "Technologie a metody analýzy nukleových kyselin" je vytvořen pro studenty biologie na PedF UK v Praze. Je tudíž organizován tak, aby studenti získali informace o zásadách sběru, uchování a analýz genetického materiálu v molekulárně genetické laboratoři za pomoci nejčastěji používaných molekulárně genetických metodických přístupů.
Hlavní témata jsou adresována buněčným extrakcím a izolacím, fragmentaci a hybridizaci NK, klonování a genovému inženýrství, problematice embryonálních a dospělých kmenových buněk, obecným principům a specializovaným technikám polymerázové řetězové reakce (PCR), sekvenaci NK, metodám separace a detekce fragmentů, technologii DNA čipů a genové terapii. Teoretický seminář je doplněn 1,5 denním praktickým cvičením v molekulárně genetické laboratoři.