Náplň přednášek

Úvod do proteomiky

Úvod a definice základních pojmů: proteom a proteomika; biochemie proteinů; od genomu k proteomu; stručný vývoj a význam proteomiky; základní rozdělení a metodické postupy.

Separační metody v proteomice

Proteom jako komplexní směs; vlastnosti peptidů a proteinů; chromatografické metody: chromatografie na obrácených fázích, iontově výměnná chromatografie, molekulová vylučovací chromatografie, hydrofilní interakční chromatografie, afinitní chromatografie, vícedimenzionální chromatografie; elektromigrační separační metody: gelová elektroforéza, izoelektrická fokusace, dvoudimenzionální elektroforéza, kapilární elektroforéza; jiné separační metody v proteomice: dialýza, diferenciální centrifugace, průtoková cytometrie; hmotností spektrometrie.

Hmotnostní spektrometrie (MS) v proteomice

Úvod a definice základních pojmů; stručná historie; základní procesy v MS; ionizační techniky pro proteomickou analýzu: ESI, MALDI; hmotnostní analyzátory pro proteomickou analýzu: kvadrupól, iontová past, analyzátor doby letu, iontová cyklotronová resonance s Fourierovou transformací, harmonická orbitální past - Orbitrap; detektory v MS; tandemová MS a kombinace MS analyzátorů.

Interpretace MS spekter v proteomice

Hmotnostní spektrum; rozlišení a monoisotopická vs průměrná molekulová hmotnost; přesnost a správnost měření; MALDI spektra peptidů a proteinů, ESI spektra peptidů a proteinů; výpočet molekulové hmotnosti z ESI spekter; identifikace proteinů pomocí peptidového mapování a sekvenování proteinů.

Bioinformatika v proteomice

Úvod a definice základních pojmů; stručná historie; sekvenční databáze; formáty dat; proteinové sekvenční databáze a UniProt; lidský proteinový atlas; volně dostupné bioinformatické zdroje.

Kvantitativní proteomická analýza

Úvod a definice základních pojmů; stanovení koncentrace celkového proteinu; kvantifikace jednotlivých proteinů; metody cílené kvantifikace: metody založené na protilátkách, metody založené na MS; metody globální kvantifikace: gelové metody, metody založené na MS; značící a neznačící metody pro globální kvantifikaci proteinů; DDA vs DIA analýza.

Možná uplatnění proteomiky směrem do klinické praxe

Formy uplatnění; uplatnění gelových metod, metod založených na protilátkách; měření MS profilů a globální proteomické analýzy; proteomika ve výzkumu klinicky závažných oblastí: identifikace klinicky využitelných markerů, studium patogeneze chorob a působení léčebných intervencí a studium mechanismu účinků a toxicity léčiv; HUPO projekt.

Náplň seminářů a praktických cvičení

Strategie přípravy vzorků pro proteomickou analýzu

Cíle proteomických analýz; determinanty přípravy vzorků; požadavky na přípravu vzorků; kroky v přípravě vzorků; hlavní nekompatibility v proteomických analýzách založených na gelových metodách a metodách využívajících kapalinovou chromatografii a MS.

Práce s bioinformatickými nástroji

Databázové nástroje: UniProt, ExPASy, BLAST; identifikace proteinů: formáty dat; prohledávací programy a parametry prohledávání.

Praktická příprava vzorku – enzymatické štěpení proteinu v gelové matrici

Praktické cvičení zahrnující zpracování gelu po elektroforéze, vyřezání spotu, modifikace proteinů v gelu, štěpení v gelu, purifikace peptidů.