Předmět Cytometrie je vyučován ve 4 cyklech, kdy v každém z nich je série 3 dvouhodinových přednášek (1,5 hodiny čistého času) vždy zakončená jedním praktickým 3-hodinovým cvičením (2 a 1/4 hodiny čistého času), a to ihned po poslední přednášce v dané sérii.

1. cyklus: Základy cytometrie

PŘEDNÁŠKY:

1. Základy cytometrické technologie - termíny a kus historie
Klasifikace cytometrických technik - ruzné druhy detekce jednotlivých částic až po cytomiku (průtoková, hmotnostní, obrazová, -omics kombinace). Historie, parametry měřitelné pomocí průtokové cytometrie, základní části průtokového cytometru. Fluidika, laminární proudění, průtoková komůrka, hydrodynamická fokusace, principy sortingu.
Elektronika a optika průtokových cytometrů - zdroje světla, rtuťové výbojky a lasery, optické filtry. Detekce světelných pulzů, fotodiody a fotonásobiče, parametry světelného pulzu. Zesilovače signálu, digitální zpracování signálů, kompenzace fluorescence, typy zobrazení výsledků analýzy.

2. Jednoduché aplikace průtokové cytometrie
Úvod do analýzy dat - obsah jaderné DNA, stanovení ploidie, určení velikost jaderného genomu, identifikace mezidruhových hybridů, detekce aneuploidie, určení způsobu reprodukce, analýza kinetiky buněčného cyklu, apoptóza, endoreduplikace, analýza genové exprese, studium fytoplanktonu.

3. PRAKTICKÉ CVIČENÍ: Základy praktické analýzy dat
Představení open source SW pro základní způsob analýzy (FCSalyzer, příp. Flowing Software), komplexní SW balíky (SW: FlowJo, BC Kaluza, BD DiVa) a otevřená platforma R.
What you see is what you get: datové standardy, kvalita dat, čištění dat, rozlišení a distribuce dat, škálování, transformace, základní způsoby zobrazování, jedno- a víceparametrická analýza DNA.

Zápočtový test #1

2. cyklus: Základní cytometrické aplikace

PŘEDNÁŠKY:

4. Principy fluorochromů a praktické využití cytometrie v biotechnologiích a v biomedicíně
Zopakování předchozí praktické části s důrazem na standardizaci a reproducibilitu měření.
Malé fluorochromy a fluorescenční proteiny, FRET (fluorescenční přenos energie) - tandemy a biosenzory.
Selekční metody producentů v biotechnologiích, environmentální analýza, vazba na -omics metodiky.

5. Opakování, korelace měření a zobrazení dat
Opakování optiky: 3 osy v průtokové cele cytometru, laser delay, excitace a emise fluorochromů (emise fotonů a průchod optickými filtry a dichroickými zrcadly), prohlížeče spekter ("spectra viewer"), detektory (fotodiody, fotonásobiče, APD), zesilovače signálu.
Analýza dat: parametry a detekce světelných pulzů, digitální zpracování signálu, nutnost kompenzace přesvitu fluorescence, typy zobrazení výsledků analýzy (1D, 2D, 3D, 4D-kinetika, multiD včetně vysvětlení redukce dimenzionality).

Funkční testy v cytometrii
Apoptóza, proliferace, signalizace, membránový potenciál, kinetické testy, vzácné populace, metabolismus.
Imunofenotypizace buněk a tkání: imunitní odpověď, nádory, infekce, mikrovesikly/mikropartikule.

6. PRAKTICKÉ CVIČENÍ: Návrh experimentu
Návrh experimentu (který provedeme ve 3. praktické hodině) a limity cytometrické metodiky (statistika a pozadí - rare cell, autofluorescence, kompenzace, základy kombinací fluorochromů, návrh panelů protilátek) a teorie vlastní přípravy vzorku (pevné tkáně, bakterie, kvasinky, viry, "biosafety“ regulace)

3. cyklus: Detailní analýza a měření dat

PŘEDNÁŠKY:

7. Návod pro analýzu dat (titrace / voltrace)
Ukázka analýzy vzorových titrovaných dat, měření titrovaných vzorků.

8. Práce s reálnými daty
Kalkulace SI v FCSalyzeru, příprava reportu

Zápočtový test #2

9. PRAKTICKÉ CVIČENÍ: Příprava vzorku a měření multiparametrických dat
Příprava osmibarevného panelu monoklonálních protilátek dle doporučení EUROFLOW, značení a měření vzorku krve na 8-barevném cytometru BDFACSVerse (plus jednom dalším s více detektory = LSR-II, CytoFLEX S).

4. cyklus: Analýza multiparametrických dat

PŘEDNÁŠKY:

10. Základní principy analýzy multiparametrických dat (FlowJo – úvod)
Kompenzace dat, vizualizace, škálování, transformace, normalizace. Určení populací, FMO kontroly a kontroly obecně, konkatenace souborů, grafické a statistické výstupy ve FlowJo

11. Nácvik kompenzace dat (FlowJo)

12. PRAKTICKÉ CVIČENÍ: Práce s naměřenými daty
Použití komerčního SW (FlowJo) pro supervizovanou analýzu a R nástrojů pro nesupervizovanou analýzu naměřených dat, kontrola kvality naměřených dat, způsob jejich hodnocení, reportování, řešení problémů... příprava ke zkoušce

Zápočtový test #3