I. ČÁST - TRVALÉ PREPARÁTY

Vývojová stadia žáby Drápatky vodní - Xenopus laevis

Cíl: nakreslit, popsat a určit jednotlivá vývojová stadia Xenopus laevis

Předložená stadia:

1. oocyty
2. stadium 2 buněk
3. stadium 4 buněk
4. stadium 8 buněk
5. stadium 16 buněk
6. blastula
7. stadium ocasního pupene
8. pulec

Řezové preparáty

varle - Xenopus laevis
fragment ovaria - Xenopus laevis
varle - myš
ovarium - myš
oplozené oocyty Xenopus laevis - pronukleus (pigmentová stopa spermie)

spermie:

myš
čolek
dešťovka
křeček
drápatka

II. ČÁST - ZRÁNÍ PRASEČÍCH OOCYTŮ A IN VITRO FERTILIZACE

Zrání prasečích oocytů a in vitro fertilizace

Obecný úvod

Oogeneze u savců

Samičí pohlavní buňky u savců procházejí 3 důležitými stádii:

1. Dělení - mitotický vznik oogonií (počet založen před narozením)

2. Růst - syntéza proteinů, různých mRNA a dalších důležitých komponent pro časný embryonální vývoj. Společně s rostoucím oocytem dochází ke vzniku folikulu, který svou tekutinou brání zrání oocytu. Oocyt je většinou zastaven v prometafázi I meiotického dělení. (1. meiotický blok). Jádro se nazývá zárodečný váček (GV - Germinal Vesicle).

3. Zrání - po ovulaci se oocyt uvolní z folikulu, čímž dojde k tzv. znovuzahájení meiozy. To se projeví rozpadem zárodečného váčku (GVBD-Germinal Vesicle Break Down) a posléze uspořádáním chromozómů do metafáze I. Po krátké anafázi I - telofázi I oocyt vyčkává na oplození většinou v metafázi II, kdy je možné pozorovat vyloučené 1. pólové tělísko. Přechody mezi jednotlivými fázemi jsou hlavně řízeny CDK1 (Cdc2) a cyklinem B, které dohromady tvoří MPF (Maturation Promoting Factor). Hladina jeho aktivní formy je nejvyšší v metafázi I a hlavně v metafázi II. V období anafáze I - telofáze I je naopak hladina této formy nejnižší. U savců je oocyt až do oplození většinou zastaven v metafázi II (2. meiotický blok). Po uvolnění z prostředí folikulu dochází GVBD do 6-ti hodin. Metafáze I je pozorovatelná mezi 20 - 24 hodinou. Metafáze II pak mezi 42-48 hodinou od izolace.

Oplození u savců

Spermie v pohlavním traktu samice u savců procházejí procesem kapacitace. Po té jsou schopné oplození. Ke kontaktu spermie a oocytu dochází zhruba v horní třetině vejcovodu. Spermie překoná vrstvy kumulárních buněk a po kontaktu se zónou pellucidou dochází k akrozomální reakci (vylití proteolytických enzymů). Po průniku spermie do oocytu nedochází u savčích oocytů ke klasickému rychlému bloku polyspermie (změna polarity oocytární membrány), který známe od ježovky. Ten nemusí být tolik potřebný vzhledem k relativně malému počtu spermií, které se k oocytu dostanou. Dochází však k vylití tzv. kortikálních granulí z oocytu (ekvivalent pomalého bloku polyspermie) a dlouhodobému zabránění vazby a průniku dalších spermií přes zonu pellucidu. Tento proces proběhne mezi 30-60 minutami po oplození a během této doby dojde i ke změnám na plasmatické membráně, které znemožní průnik spermií do cytoplasmy. Průnikem spermie do oocytu dojde pak k jeho aktivaci oscilacemi Ca²⁺iontů a k dokončení meiozi. Vzniká tak postupně samičí prvojádro. Současně hlavička spermie začíná dekondenzovat do podoby samčího prvojádra. U obou prvojader po té dochází k syntéze DNA. U savců, na rozdíl např. od ježovky, nedochází v tomto okamžiku k jejich fúzi ale k oddělené kondenzaci do chromozómů v rámci profáze. Po té jsou samčí a samičí chromozómy promíchány v ekvatoriální rovině a během anafáze a telofáze vznikají dvě pravá somatická jádra.

Praktická část

Úkol pro 1. den

Izolace prasečích oocytů z folikulů aspirační metodou.

Folikuly vaječníku nabodneme injekční stříkačkou s jehlou a odsáváme folikulární tekutinu, která obsahuje volné oocyty obalené vrstvami kumulárních buněk. Uděláme si také foto vaječníku pod stereomikroskopem (obr. I). Po té aspirovanou tekutinu přeneseme do víčka 3 cm Petriho misky.

Pod stereobinolupou skleněnou kapilárou nasáváme jednotlivé oocyty, které přenášíme do druhé 3 cm Petriho misky se 4 kapkami (4 x 50 µl) manipulačního média (M2) pod olejem. Izolované oocyty prohlížíme pod stereobinolupou. Prasečí oocyty jsou tmavé (lipidová granula) a jsou obaleny několika vrstvami kumulárních buněk. Oocyty si následně vyfotíme pod stereomikroskopem do tabla (obr. A). Oocyty spočítáme a rozdělíme do dvou skupin. 1. skupina by měla odpovídat cca 1/3 z celkového počtu vámi vyizolovaných oocytů a je určena pro fixaci po 24 hodinách kultivace (stádium metafáze I). Ve 2. skupině by měly být zbylé 2/3 oocytů a ty necháme kultivovat 42-48 hodin do stádia metafáze II s následným in vitro oplozením kančími spermiemi.

1. skupinu oocytů přeneseme skleněnou kapilárou do 4-jamkové destičky s 500 ml média M199 se 4 mg/ml GPBoS (růstové proteiny bovinního séra) překrytého 500 µl parafinového oleje. 2. skupinu obdobně přeneseme do druhé 4-jamkové destičky se stejným médiem. Při přenosu dáváme pozor, abychom oocyty přenesli do média na dně jamky, a nevypustili je do oleje nad médiem. Jamky s oocyty si označíme. Poté obě destičky kultivujeme v termostatu při teplotě 38,5 °C a 5% CO₂.

Úkol pro 2. den

Fixace 1. skupiny oocytů po 24 hodinové maturaci

Z termostatu vyjmeme 4 jamkovou destičku s oocyty určenými pro fixaci v metafázi (1. skupina oocytů) a rychle vyfotíme pod stereomikroskopem (obr. B). Do každé z jamek napipetujeme á 25 ml 0,1% hyázy (Hyaluridonáza) a zamícháme. Tento enzym rozvolní expandovaný kumulus a umožní odstranění jeho buněk. Asi po 3-5 minutách oocyty přeneseme do kapky manipulačního média (M2) v 3 cm Petriho misce a odstraníme zbylé kumulární buňky protahováním tenkou skleněnou kapilárou. Po očištění si všímáme poměrně silné zóny pellucidy, která je dobře patrná při polovičním zástinu. Oocyty poté přeneseme do 500 µl 4% roztoku formaldehydu v PBS, který budete mít ve 4-jamkové destičce, a zde je fixujeme do dalšího dne při 4 °C.

Úkoly pro 3. den

1. In vitro fertilizace

Spermie určené pro in vitro fertilizaci označíme vitálním barvením jádra a mitochondrií (Hoechst 33258 + Mitotracker Red CMX Ros) následujícím způsobem.

Odpipetujeme 3 ml spermií do 10 ml zkumavky s modrým uzávěrem. Zkumavku centrifugujeme při 700G (2.650 ot/min – centrifuga MPW-340) po dobu 5 minut. Pasteurovou pipetou odebereme supernatant a přidáme 7 ml sterilního PBS + 0,01% PVA (polyvinylalkohol) z lahvičky. Vše důkladně zamícháme a centrifugujeme 5 minut při 700 G. Tento krok opakujeme ještě jednou. Na závěr odsajeme supernatant a spermie velmi důkladně resuspendujeme ve 2 ml PBS + 0,01% PVA. Z této suspenze si co nejdříve přeneseme 500 µl do 1,5 ml ependorfky a přidáme 5 µl Mitotrackeru (1 mM roztok v DMSO) a 2 µl Hoechst 33258 (1 mg/ml). Důkladně zamícháme a necháme inkubovat při 17 °C. Tyto spermie budeme po používat na umělé oplození (po alespoň 30 minutách inkubace) a pro pozorování samotných spermií (po 1-2 hodinách inkubace).

Do další 1,5 ml ependorfky napipetujeme 990 µl destilované vody. Z původní suspenze ve zkumavce odebereme 10 µl, které přidáme do ependorfky s vodou a důkladně promícháme (spermie jsou nyní 100 x ředěné a jsou znehybněné). Takto vzniklá suspenze je určená pro počítání spermií. Zbytek původní suspenze odložíme do boxu s teplotou 17 °C.

Zjištění koncentrace spermií na mililitr provedeme následujícím způsobem. Ze 100x ředěné suspenze (v ependorfce s vodou) odebereme 10 µl a aplikujeme je mezi krycí a podložní sklo Burkerovy komůrky. Komůrku umístíme do mikroskopu a spočítáme spermie, které se nacházejí v 16 velkých čtvercových polích (oblast je ohraničena trojitou rýhou). Nepočítáme ty spermie, které leží mezi velkými čtverci. Postup opakujeme ještě 3 x, vždy na jiných místech Burkerovy komůrky. Výsledné čtyři hodnoty zprůměrujeme. Koncentraci spermií na ml vypočteme podle následujícího vzorečku:

X = (průměrný počet spermií v 16 velkých polích) x 15 625 x 100

Vysvětlení výpočtu:

Plocha jednoho velkého čtverce = 0,04 mm², hloubka komůrky = 0,1 mm

Objem tekutiny nad jedním velkým čtvercem = 0,04 x 0,1 = 0,004 mm³ (µl)

Objem tekutiny nad 16 velkými čtverci = 0,004 x 16 = 0,064 mm³ (µl)

Přepočet na 1 cm³ (ml) = 1000 / 0,064 = 15 625 (koeficient ve vzorečku)

Suspenzi jsme 100 x ředili. Proto je nutné výslednou hodnotu vynásobit.

Zatímco část skupiny počítá spermie, zbylí členové si vyndají 4-jamkovou destičku s oocyty maturovanými do metafáze 2, vyfotí je (obr. C) a očistí tyto oocyty maturované