Praktická cvičení:

nácvik přesnosti a sebekontroly při dávkování rozpuštěných látek pipetováním

dělení směsí látek chromatograficky (na příkladech jednosměrné TLC, papírové radiální, sloupcové na gelu)

extrakcelipofilního vitaminu z rostlinného materiálu; s následnou kontrolou čistoty preparátu spektrofotometrickým proměřením absorbancí

molekulární biologie (na příkladu SNP Leiden V.): odběr nativního vzorku DNA a jeho preparace, přípravy „master mixu“ a zkoumaných vzorků pro PCR, elektroforetické dělení produktů PCR a restrikčních fragmentů, diagnostické vyhodnocení elfo-gramu

polarimetrie a spektrofotometrie; vytvoření kalibračního grafu, identifikace AB indikátorů, polarimetrické stanovení koncentrace látek a rozlišení R a S enantiomerů

potenciometricky sledované chování kyselin (silné minerální, slabé organické a aminokyseliny) při titraci silnou zásadou; odečtení a vyhodnocení údajů z grafu průběhu titrace

osmotické jevy (osmolalita, osmóza, dialýza) rozdíly mezi difusí a osmosou

magistraliter příprava roztoku isoosmotického s plasmou a jeho kontrola prostřednictvím kryoskopické osmometrie

titrační sledování průběhu dialysy přes semipermeabilní rozhraní

kvantifikace a porovnání antioxidačních kapacit vybraných analytů (sérum krevní, sliny, vitamin C, vitamin E, komerčních směsných antioxidačních preparátů) technikami TEAC = trolox equivqlent antioxidant capacity a FRAP = rerric reducing antioxidant power

sérum krevní-diagnosticky významné analyty: celkový cholesterol enzymaticky; modelový příklad vyhodnocení aterogenního rizika, glukosa, močová kyselina, močovina, anionty chloridové spektrofotometricky a iontově selektivní elektrodou, kationty vápenaté, draselné a sodné, přímý a celkový bilirubin

plasmatické bílkoviny – stanovení celkové koncentrace bílkovin a frakce albuminové, elektroforetické dělení a barvení na agarosovém gelu, imunoprecipitace a barvení séra polyvalentním antisérem na agarovém gelu, vyhodnocení dysproteinémií z nálezů certifikované laboratoře

moč - sensorické, fyzikální a chemické vlastnosti; kvalitativní zkumavkové důkazy přítomnosti

bílkovin, redukujících sacharidů, ketolátek, krevního barviva, barviv žlučových, aminokyselin a jejich metabolitů

sediment močový (zhotovení a vyhodnocení barveného preparátu)

funkční zkouška ledvin stanovením clearance endogenního kreatininu

α-amylasa v moči- spektrofotometricky z produktů hydrolytické reakce a metodou podle Wohlgemutha

mozkomíšní mok – vyšetření přítomnosti bílkovin, glukosy, laktátu

acidobasická rovnováha (seminář) iontogram plasmy, vztah poruchy ABR a minerálového hospodářství, pufrovací systémy krve, pH, respirační a metabolická složka_,base deficit a base exces, Buffer Base Serum, Anion Gap, Strong Ion Difference, Unmesurment Anions, poruchy ABR, podíl plic a ledvin na udržování ABR a kompensaci poruch

enzymologie – stanovení aktivit vybraných enzymů (alkalické fosfatasy, erythrocytární katalasy, ALT a AST, aldolasy, laktátdehydrogenasy)

– demonstrace principu kompetitivní inhibice na sukcinátdehydrogenase z mitochondrií srdeční tkáně

– sledování oxidačního vlivu xanthin-oxidoreduktasy na substrát

– zjištění pH optima pro aktivitu slinné amylasy

– porovnání specifit α-amylasy a sacharasy

– zjištění Michaelisovy konstanty kyselé fosfatasy) a vyhotovení grafu v reciprokých hodnotách

Přednášky:

1. Úvod do studia biochemie

Biochemie a její místo v systému biologických, chemických a lékařských věd. Úloha biochemie v současné medicíně, její perspektivy.

2. Vlastnosti peptidů a proteinů

Rekapitulace aminokyselin a jejich třídění z hlediska polarity vedlejších řetězců, z hlediska acidobasických vlastností a z hlediska esenciálnosti. Výstavba peptidů a proteinů, jejich primární struktura. Informace o zjišťování primární struktury. Struktury vyšších řádů a jejich význam pro funkci peptidů a proteinů.

3. Enzymy

Základní charakteristika enzymů a základní vlastnosti enzymů. Substrátová a reakční specifita enzymů. Enzymy jako bílkoviny. Apoenzymy a koenzymy. Aktivní centrum enzymů. Mechanismus katalytického působení enzymů, příklady. Thermodynamické a kinetické aspekty enzymové katalysy. Rychlost enzymové reakce, Michaelisova konstanta a její praktický význam. Inhibice enzymové reakce. Inhibitory kompetiční a nekompetiční. Allosterické enzymy a allosterická inhibice a aktivace, její význam v metabolismu. Isoenzymy - vztah ke genovému uspořádání, význam funkční a medicinsko-diagnostický. Klasifikace enzymů.

4. Energetika metabolismu, úloha makroergních sloučenin

Chemické děje z thermodynamického hlediska. První a druhá věta thermodynamická. Enthaplie, volná energie, entropie. Děje endo- a exotermické. Entropie a živé systémy. Konzervace a přesun energie v živém systému, makroergní sloučeniny, ATP.

5. Oxidoredukční děje jako zdroj energie

Oxidace a redukce. Redoxní potenciál a standardní redoxní potenciál. Thermodynamika přenosu elektronů. Redoxní děje jako hlavní zdroj energie aerobních organismů.

6. Tkáňové dýchání a jeho význam v metabolismu

Mitochondrie a její stavba. Dehydrogenasy a jejich funkce. NAD a NADP. FMN a FAD. NADH dehydrogenasa. Koenzym Q. Cytochromový systém. Cytochrom c reduktasa a cytochrom c oxidasa. Celkové uspořádání dýchacího řetězce, přesuny elektronů a přesuny protonů. Vznik protonového gradientu a jeho využití. Syntéza ATP jako důsledek protonového gradientu. Stechiometrie dehydrogenace a tvorby ATP. Protonový gradient a tepelná regulace. Inhibitory tkáňového dýchání, jejich experimentální a medicinský význam.

7. Citrátový cyklus

Struktura KoA, jeho vznik a funkce. Acetyl-KoA. Sled a popis metabolických přeměn v citrátovém cyklu. Dehydrogenační stupně citrátového cyklu a jejich spojení s tkáňovým dýchaním. Energetický výtěžek citrátového cyklu. Regulace citrátového cyklu na úrovni jednotlivých enzymů. Amfibolická povaha citrátového cyklu - nutnost doplňování cyklu. Hlavní anaplerotické (doplňující) reakce - pyruvátkarboxylasa. Mechanismus karboxylace, úloha biotinu.

8. Metabolismus sacharidů - glykolysa

Popis jednotlivých glykolytických přeměn a enzymů katalyzujících tyto reakce. Glykolysa v aerobních a anaerobních podmínkách. Význam a vzájemné propojení glyceraldehydfosfátdehydrogenasy a laktátdehydrogenasy. Vznik laktátu. Energetický výtěžek glykolysy v aerobních a anaerobních podmínkách. Regulace glykolysy. Význam fosfofruktokinasy a fruktosa-2,6-bisfosfátu. Aktivace typu feedforward.

9. Další přeměny pyruvátu

Anaerobní přeměna na laktát a její smysl. Alkoholové kvašení. Karboxylační přeměna na oxalacetát. Oxidační dekarboxylace pyruvátu a přeměna na acetyl-KoA. Celková energetická bilance přeměny glukosy za různých podmínek. Lokalizace jednotlivých metabolických pochodů v buňce, spojení extra- a intramitochondriálních redoxních dějů, malátový spoj, glycerolfosfátový spoj.