Diagnóza roztroušené sklerózy se opírá o typickou diseminaci v prostoru a čase. Mezi nejčastější onemocnění, která tuto chorobu napodobují, patří neuromyelitis optica a akutní demyelinizační encefalomyelitida.
Diferenciální diagnóza musí zohlednit i další možnosti některých nedemyelinizačních onemocnění, přičemž je nutno brát v úvahu varující příznaky a nálezy (red flags). Zvlášť důležité je správné vyhodnocení nálezů u klinicky izolovaného syndromu.
Chybná interpretace může vést i k nesprávně vedené léčbě.