Optimalizace protokolu pro vyšetření genové exprese pomocí RTqPCR z tkáně zalité do parafinových bloků
Abstrakt
Tkáň fixovaná v parafínu (FFPE) je nejběžnější typ materiálu dostupného retrospektivně. Bohužel, pokusy o extrakci RNA z této tkáně často konč í neúspěšně získáním malého množství degradované molekuly.
Naše studie se týká analýzy genové exprese z FFPE materiálu pomocí RTqPCR metody. Celý protokol se skládá z několika kroků: RNA extrakce, kontrola její kvality, reverzní transkripce a RTqPCR detekce.
V každém kroku jsme porovnali několik několik metod, vybrali nejlepší a sestavili předkládaný protokol. S ním jsme úspěšně analyzovali 95% vzorků (62/65).
Nejlepší se jevila tato kombinace metod: RNA extrakce komerčním kitem, opatrně interpretovaná spektrofotometrická kontrola kvality RNA, pečlivě zvolená reverzní transkriptáza a detekce genů pomocí TaqMan sond. Předkládaný protokol zvyšuje možnost využití FFPE materiálu pro metody molekulární biologie.