Abstrakt
Zubní dřeň představuje relativně snadno dostupný zdroj mezenchymových kmenových buněk. Cílem studie bylo optimalizovat proces izolace KBZD, zejména zkrátit dobu, po kterou je zubní dřeň enzymaticky štěpena.
U KBZD izolovaných novým postupem stanovit proliferační aktivitu, fenotyp, viabilitu a ověřit schopnost jejich diferenciace ve zralé buněčné typy - osteoblasty, chondroblasty a adipocyty. Extrahovali jsme celkem pět stálých zubů a izolovali pět buněčných linií, které jsme kultivovali v modifikovaném kultivačním médiu (α-MEM) pro adultní mezenchymové progenitorové buňky, obohaceném o 2 % fetálního bovinního séra, růstové faktory, antibiotika, antimykotika, a doplněném o Insulin-Transferrin-Sodium-Selenium supplement (ITS).
Pro stanovení viability, počtu a velikosti buněk jsme použili přístroje Vi-Cell analyzer a Z2-Counter. Fenotypová analýza byla provedena pomocí průtokového cytometru Cell Lab Quanta.
Pro diferenciaci v chondroblasty, osteoblasty a adipocyty jsme použili komerčně dostupná diferenciační média. Průkaz diferenciace jsme dokazovali imunohistochemicky (osteokalcin a kolagen typu II) a histologickým barvením (modrý Massonův trichrom, barvení dle Kossy a olejová červeň).
Výsledky: KBZD jsme kultivovali do 8. pasáže. Buňky dosáhly průměrně 47,8 +- 2,0 populačních zdvojen í (angl. population doublings; PD).
Průměrný čas potřebný pro zdvojení populace (angl. doubling time; DT), činil 39,2 +- 6,1 hodin. Po celou dobu kultivace byly buňky proliferačně aktivní.
Průměrná viabilita v 2. pasáži byla 92,3 +- 1,5 % a v 8. pasáži 92,4 +- 1,4 %. Fenotypovou analýzou jsme prokázali vysokou expresi povrchových antigenů pro mezenchymové kmenové buňky (angl. cluster of differentiation; CD) CD13, CD29, CD44, CD90, pro tzv. "stromal associated" znaky CD73, CD166, a naopak nízkou či nízce pozitivní expresi znaků CD31, CD34, CD45, typických pro endoteliální a hematopoetickou buněčnou řadu.
KBZD se diferencovaly ve zralé buněčné typy, osteoblasty a chondroblasty. I přes proadipogenně silně působící médium buňky nediferencovaly v adipocyty.
Podařilo se nám optimalizovat izolační protokol pro KBZD tím, že jsme zkrátili dobu, po kterou je zubní dřeň enzymaticky štěpena. KBZD izolované touto metodou prokazovaly po celou dobu kultivace vysoký proliferační a diferenciační potenciál.
Nezpozorovali jsme žádné známky spontánní diferenciace či degenerace. Právě pro vysokou proliferační aktivitu, široký diferenciační potenciál a snadnou dostupnost představují KBZD budoucnost v regenerativní medicíně.