Abstrakt
Cíle: Ověření vlivu kryokonzervačního média obsahující kys. hyaluronovou (HA) o vysoké molekulární hmotnosti (1,5 MDa) v koncentraci 0,1 % a dimethyl sulfoxidu (DMSO) jako kryoprotektiva (KPA) v koncentraci 3 % na kmenové buňky izolované ze zubní dřeně (KBZD). Závěr: V tomto výzkumu jsme se zaměřili na sledování vlivu kryokonzervačního média obsahující kys. hyaluronovou (HA) o vysoké molekulární hmotnosti (1,5 MDa) v koncentraci 0,1 % a dimethyl sulfoxidu (DMSO) jako kryoprotektiva (KPA) v koncentraci 3 % na kmenové buňky izolované ze zubní dřeně ve snaze snižovat koncentraci DMSO v použitém kryokonzervačním médiu.
Vliv na počet, viabilitu, fenotyp a schopnost diferenciace v osteogenní a chondrogenní buněčné řady byl sledován v porovnání vůči dvou kontrolním skupinám - KBZD standardně zmrazené s použitím 10% DMSO (kontrolní podskupina 1) a KBZD zmrazené s použitím 3% DMSO bez vlivu kys. hyaluronové (kontrolní poskupina 2). Právě kombinace nízkomolekulárního a vysokomolekulárního kryoprotektiva se jeví jako jedna z možností, jak ochránit buňky intra- i extracelulárně během poklesu teplot.
U KBZD kryokonzervovaných s použitím 3% DMSO a 0,1% kys. HA jsme pozorovali nejvyšší průměrnou viabilitu přes 89 %, u kontrolní podskupiny 1 přes 87 %, kontrolní podskupiny 2 přes 85 %.
U žádné podskupiny jsme nepozorovali změnu tvaru. Buňky si zachovaly fibroblastům podobný tvar po celou dobu kultivace po rozmrazení.
KBZD kryokonzervovaným s použitím pouze 3% DMSO bez kys. HA trvalo dvojnásobně déle dosáhnout 70 - 90% konfluenci po rozmrazení a i přesto byl průměrný počet získaných buněk menší v porovnání s kontrolní podskupinou 1 či podskupinou 3.
Ze získaných dat lze usuzovat, že při 3% DMSO jako kryoprotektiva bez kombinace s kys. hyaluronovou není ochrana buněk při poklesu teplot hluboko pod bod mrazu dostatečná. Výtěžnost viabilních buněk po rozmrazení je malá.
KBZD trvá déle obnovit jejich "funkční" zdraví. Při analýze fenotypu jsme pozorovali pokles exprese CD31, CD73, CD117 u všech podskupin, u znaku CD146 byl pokles výraznější u podskupin 2,3 oproti analýze před kryokonzervací.
Naopak jsme pozorovali zvýšenou expresi znaku CD49f u podskupiny 3 po kryokonzervaci. Mezi jednotlivými podskupinami nebyly výrazné rozdíly mimo zmiňované zvýšené exprese znaku CD49f u podskupiny 3.
CD49f patří do skupiny integrinů, membránových receptorů, které se vážou na extracelulární matrix či na jiné buňky. Umožňují tím přilnutí buněk k podkladu a tak é migraci buněk, což naznačuje jejich roli ve vývoji a hojení tkání.
CD49f se exprimuje na mnoha typech kmenových buněk a může být považován za "stemness" znak, jelikož s jeho rostoucí expresí se zvyšuje také schopnost sebeobnovy, proliferace a diferenciační kapacita KBZD. KBZD ze všech podskupin si zachovaly schopnost diferenciace v osteoblastům a chondroblastům podobné buňky.